BILIRUBINA DIRECTA JAS-YAZ (TÉCNICA)

BILIRUBINA DIRECTA JAS-YAZ (TÉCNICA)

USO

Este reactivo es utilizado para la determinación cuantitativa in vitro de Bilirubina Directa en suero humano.

SIGNIFICADO CLINICO

Los glóbulos rojos, al final de su vida circulante, son destruidos en el sistema retículo endotelial, principalmente en el bazo. El grupo hemo resultante, una vez separado del hierro, se convierte en bilirubina. Este proceso es responsable de aproximadamente un 80% de los 300 mg de bilirubina que se forman al día. Otras fuentes de bilirubina son la destrucción de mioglobina y citocromos y el catabolismo de glóbulos rojos inmaduros en la medula ósea.

Una vez formada, la bilirubina es transportada al hígado unido a la albúmina ya que es insoluble en agua. Esta fracción de bilirrubina se conoce como bilirrubina indirecta o no conjugada. En el hígado la bilirrubina se conjuga con ácido glucuronico (mono y diglucuronidos) para formar la bilirrubina conjugada por acción de enzima uridil di fosfato glucuronil transferasa. Esta bilirrubina conjugada o bilirrubina directa es excretada, vía estercobilinogeno por el intestino. La eliminación es casi completa y los niveles en plasma son normalmente despreciables.

La bilirrubina total es la suma de las fracciones conjugada y no conjugada. La bilirrubina total esta elevada en condiciones que causan obstrucción del conducto biliar, hepatitis, cirrosis, enfermedades hemolíticas y varias deficiencias enzimáticos heredadas. La bilirrubina indirecta esta elevada por causas pre-hepáticas tales como desordenes hemolíticos o enfermedades hepáticas que dan como resultado alteraciones en la entrada, transporte y conjugación en el hígado.

El monitoreo de la bilirubina en el recién nacido, particularmente si es prematuro, es de gran importancia. Puesto que el metabolismo hepático de la bilirubina en tales casos es inmaduro, es común la ictericia en el recién nacido, debida a un aumento de la bilirrubina no conjugada o indirecta. La bilirrubina no conjugada, si no esta unida a albumina, es capaz de atravesar la barrera hematoencefalica mas fácilmente, aumentando el peligro de daño cerebral.1

METODO

La mayoría de métodos actuales son basados en la reacción entre bilirubina y soluciones de ácido sulfanilico diazotados. En solución acuosa solo la bilirubina directa (conjugada) reaccionara de esta manera. Este reactivo de bilirubina directa usa el método de ácido diazo. Bilirubina Conjugada reacciona con ácido sulfanilico diazotado para producir un ácido azobilirubina, la absorbancia la cual es proporcional a la concentración de bilirubina directa en la muestra, puede ser medida a 550nm. Para analizadores bicromaticos la lectura del blanco debe ser tomada a 660nm.

COMPOSICION DEL REACTIVO

Ingredientes Activos Concentracion

HCI 103mM

Acido sulphanilic 9.8mM

Nitrito de Sodio 145mM

*PRECAUCIONES

1. No utilize la pipeta con la boca. Evite el contacto con

piel y ropa.

2. Este reactivo es para el uso diagnóstico in- vitro solamente.

PREPARACION DEL REACTIVO

1. Reactivo de prueba: Añadir el reactivo de Nitrito de Sodio al reactivo de Bilirubina Directa en proporción de 1:100. Por ejemplo, a 10mL de Reactivo de Bilirubina Directa, añadir 0.1mL de Nitrito de Sodio ( esto es aproximadamente 3 gotas de nitrito por cada 10mL de Reactivo de Bilirubina Directa)

2. Reactivo Blanco: Use el reactivo de Bilirubina Directa como se suple.

ALMACENAJE DEL REACTIVO

1. Almacenar el reactivo a temperatura de 2-25°C El reactivo es estable hasta la fecha de expiración.

2. El Reactivo de Trabajo es estable por lo menos 21 días almacenado de 2-8°C.

DETERIORO DEL REACTIVO

No utilice el reactivo si:

1. Esta turbio

2. La absorbancia es >0.1AU a 550nm

3. El reactivo falla en cumplir los parámetros de desempeño establecidos.

COLECCIÓN Y ALMACENAJE DE LA MUESTRA

1. Debe usarse muestras no hemolizadas.

2. Muestras deben ser protegidas de la luz brillante. Pueden ser almacenadas de 2-8°C por 3 dias.

INTERFERENCIA

1. Estudios para determinar el nivel de interferencia para hemoglobina y lipemia fueron realizados, se obtuvieron los siguientes resultados:

Hemoglobina: No interferencia significativa (+ 10%) hasta 300mg/dL

Lipemia: No interferencia significativa (+ 10%) hasta 723 mg/dL medida como trigliceridos.

2. Young, D.S.5 ha publicado un listado de drogas y sustancias que pueden interferir con el ensayo de Bilirubina Directa.

EQUIPO ADICIONAL REQUERIDO NO INCLUIDO

1. Analizador de química clínica capaz de mantener temperatura de 37°C constante y medir absorbancia a 550nm.

2. Agua deionizada y equipo relacionado,ej. Pipetas

3. Consumibles específicos para el analizador ej. Copas de Muestras

4. Material control como los suplidos por JAS Diagnostics.

PROCEDIMIENTO MANUAL

Test Blank

Reactivo de Trabajo (ml) 1.0 ------

Reactivo Bilirubina Directa (ml) ------ 1.0

Muestra (ml) 0.10 0.10

1. Identifique lus tubos de ensayo “blanco”, “control”, “paciente”, etc. Cada tubo require un tubo de blanco.

2. Añada 1.0mL de bilirrubina directa a todos los tubos de blanco.

3. Prepare un reactivo de trabajo. Vea la sección de Preparación del Reactivo en el inserto.

4. Añada 1.0mL del reactivo de trabajo a todos los tubos de ensayo.

5. Pre-caliente los tubos por aproximadamente 5 minutos a 37ºC.

6. A intervalos de tiempo añada 0.10mL (100μL) de muestra a los tubos correspondientes. Mezcle.

7. Deje descansar los tubos por 5 minutos a 37ºC.

8. Lleve el espectrofotómetro a cero con el reactivo blanco a 550nm (540-560nm).

9. Lea y registre la absorbancia de todos los tubos.

10. Vea la sección de cálculos en el inserto para obtener los resultados.

NOTA: El color continuara aumentando debido a la presencia de la fracción indirecta. El tiempo debe ser exacto para la medida precisa de la fracción directa.

PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO

Estas instrucciones son para ser utilizadas como una guía general para la adaptación al instrumento automatizado seleccionado por el usuario. Es recomendable que un blanco de muestra sea ensayado con cada muestra. Un blanco de muestra puede ser obtenido usando el reactivo de Bilirubina Directa como viene sin añadir el Nitrito de Sodio

PARAMETROS

Temperatura: 37°C

Largo de Onda 550nm

Tipo de Ensayo: Punto Final

Dirección: Aumentativo

Ratio: Muestra/Reactivo 1:20

Volumen de Muestra 0.05mL (50L)

Volumen de Reactivo 1.0 mL

Tiempo de incubación: 10 minutos

NOTAS DEL PROCEDIMIENTO

1. Los volúmenes de Muestra y Reactivo pueden ser alterados proporcionalmente para adaptarlos a los requisitos de varios instrumentos.

2. Muestras con valores mayores de 20mg/dL deben ser diluidas 1:1 con agua, y el resultado multiplicado por 2.

CALCULOS

Abs. Muestra - Abs. Blanco de muestra x Concentración Calibrador = BID2

Abs. Calibrador - Abs. Blanco del Calibrador (mg/dL) (mg/dL)

Ejemplo:

Absorbancia de la muestra = 0.350

Absorbancia Blanco muestra = 0.010

Absorbancia del Calibrador = 0.250

Absorbancia Blanco Calibrador = 0.010

Concentración del Calibrador = 4.0 mg/dL

0.350 – 0.010 x 4 = 5.7 mg/dL BID2

0.25 – 0.010

Nota: Para obtener valores en mmol/L multiplique mg/dL x 17.10 = mmol/L

Se requiere calibración. Este ensayo requiere el uso de un calibrador suero apropiado con valores conocidos de Bilirubina Directa, tal como el JAS Diagnostics Calibrador (CAL1-5).

CONTROL DE CALIDAD

La integridad de la reacción debe ser monitoreada con el uso de dos niveles de control con valores conocidos de Bilirubina Directa (CON1-5 and CON2-5). Los usuarios deben seguir las pautas o guias del gobierno referentes al uso de control de calidad externo.

VALORES ESPERADOS 6

Adultos e infantes mayores de 1 mes 0.0-0.2 mg/dL

Se recomienda que cada laboratorio verifique este rango o establezca su propio rango normal.7

DESEMPEÑO

Linearidad:

Cuando es evaluado como recomendado el ensayo es linear de 0 hasta 20 mg/dL.

Comparación del Método:

Los siguientes resultados fueron obtenidos mediante estudios realizados entre este procedimiento y uno similar:

Pares de Muestra 72

Rango de Muestras 0.00 – 20.8 mg/dL

Coeficiente de Correlación 0.9966

Pendiente 1.026

Intercepto 0.01 mg/dL

Precisión:

N=40

Entre Corridas Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3

Promedio (mg/dL) 0.20 1.83 2.98

S.D. (mg/dL) 0.00 0.03 0.00

C.V.(%) 0.00 1.7 0.00

Entre Corridas Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3

N=40 (10 días, 2 corridas por día, 2 replicas por corrida)

Promedio (mg/dL) 0.20 1.83 2.98

S.D. (mg/dL) 0.00 0.08 0.15

C.V.(%) 0.00 4.3 5.2

Sensibilidad:

Un factor de calibración de aproximadamente 29.96 fue obtenido, el cual es equivalente a una sensitividad de 0.0334  Abs por mg/dL.

* NOTA: Desempeño establecido en el Synchron CX7.

REFERENCIAS

1. Zilva JF, Pannall PR. “Liver Disease and Gall Stones” in Clinical Chemistry in Diagnosis and Treatment”. Lloyd-Luke 1979; Chap XIII; 286-8

2. Malloy HT, Evelyn KA. J Biol chem 1937; 119-481-90.

3. Jendrassik L, Grof B. Biochem Zeit 1938; 297;81-9

4. Pearlman FC, Lee RT. Clin Chem 1974; 20:447-53

5. Young DS, Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests. Thirrd Edition. AACC Press 1990

6. Clinical Chemistry Theory, Analysis, and Correlation, 3rd ed. C.V. Mosby, St Louis, p.524 (1996)

7. Watchel M et al, Creation and Verification of Reference Intervals. Laboratory Medicine, 1995; 26:593-7

JAS Diagnostics, Inc.

14100 NW 57th Court. Miami Lakes FL 33014

Datos de Contacto:Correo: distribuidora0270@gmail.com

Telef. 0212 731 8174
Horario: Lunes a Viernes de 8:00am a 12:00pm y de 2:00pm a 4:00pm

CALCIO ARSENAZO (TÉCNICA)

CALCIO ARSENAZO (TÉCNICA)

USO

Para el en Vitro determinación cuantitativa de Calcio en el suero.

SIGNIFICADO CLINICO 1 2

Calcio Aumentado del suero se puede observar en el hyperparathyroidism, embriaguez de vitamina D, múltiples mieloma y algunas enfermedades de neoplastic de hueso. El calcio disminuido del suero se puede observar en el hypoparathyroidism, en la deficiencia de vitamina D, en steatorrhea, en necrosis, y en la nefritis.

METODO:

Varias metodologías se han desarrollado para la determinación de calcio inclusive la fotometría de la llama, fluorescente, gravimetrito y los procedimientos de titrimetric, el ion electrodos selectivos, y la absorción atómica. La absorción atómica se ha recomendado como el método de referencia pero requiere instrumentación costosa. 3

Las metodologías específicas de la encuadernación del tinte han llegado a ser populares para la determinación de calcio porque ellos son rápidos, convenientes y económicos. Los procedimientos que utilizan los tintes alizarin3-sulfonate y methylthymol azul se ha descrito. 4.5 Un método que utiliza O-Cresolphthalein Complexone como el chromagen se desarrolló en 1966 por Connerty y Biggs, y modificó por Gitelman en 1967 y Baginski, et al en 1973. Los procedimientos de O-Cresolphthalein de 6,7,8 Complexone se han utilizado extensamente para la determinación de calcio.

El procedimiento presente utiliza Arsenazo III y se ha modificado para proporcionar un sistema sumamente sensible y fijo de reactivo. El reactivo se proporciona como un conveniente listo para utilizar líquido.

El principio:

Alkaline

Calcium + Arsenazo Ill Calcium- Arsenazo Complex Medium (purple color)

El calcio reacciona con Arsenazo III en un medio levemente alcalino para formar un complejo de color púrpura que absorbe en 650 nm. La intensidad del color es proporcional a la concentración del calcio.

COMPOSICION DEL REACTIVO:

Ingredientes Activa Concentración

Arsenazo III 0.2 mM

Búfer Imidazol 100 mM

Surfactante

pH (6.55 – 6.95)

Precauciones:

1. El reactivo es solamente para uso “in-vitro”.

2. El reactivo puede irritar la piel. Evite el contacto. Limpíe con agua si el contacto ocurre.

3. El reactivo contiene Sodio Azide como un preservativo. En una forma seca esto puede reaccionar con cobre o dirigir instalación de cañerías a formar azides explosivo de metal. Sobre la disposición, limpíe con cantidades grandes de agua para evitar deposito de azide.

PREPARACION DEL REACTIVO:

Se suministra listo para utilizar.

ESTABILIDAD Y ALMACENAMIENTO:

Cuando almacenado en 2-25°C, el reactivo es fijo hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta.

INDICACIONES DE DETERIORO EN EL REACTIVO

El reactivo no se debe utilizar si:

1. El reactivo es túrbido.

2. El reactivo falla de encontrar los parámetros indicados del desempeño.

COLECCION y ALMACENAJE DE LA MUESTRA:

1.Suero Fresco y no hemolizado es el espécimen preferido.

2. Los anticoagulantes de otra manera que heparina no se deben utilizar. 9

3. Remueva el suero de su coagulante tan pronto posible desde que glóbulos rojos pueden absorber calcio. 10

4. Las muestras que contienen precipitación visible no deben ser usados.11,12

5. El calcio en el suero es fijo por una semana se mantiene refrigerado (2-6°C), y hasta cinco meses congelados (-15 a -25 °C) cuando protegido de la evaporación 13

6. Muestras no se deben descongelar y volver a congelar.

INTERFERENCIAS:

1. Los estudios para determinar el nivel de interferencia para la hemoglobina, bilirubin, y lipemia se llevaron a cabo, los resultados siguientes se obtuvieron:

Hemoglobina:

Ninguna interferencia significativa (<10%) de la hemoglobina hasta 300 mg/dl.

Bilirubin:

Ninguna interferencia significativa (<10%) del bilirubin hasta 24.3 mg/dl.

Lipemia:

Ninguna interferencia significativa (<10%) de lipemia hasta 1020 mg/dl medido como triglicéridos.

2. Varias drogas y las substancias pueden afectar la certeza de esta prueba. Vea a Jóvenes, et al. 14

EQUIPO ADICIONAL REQUERIDO PERO NO INCLUIDO:

1. Un analizador clínico de química capaz de mantener la temperatura (37°C constante), y la medida de absorbancia en 650 nm (630 - 650).

2. El agua Deionizada y equipo relacionado, por ejemplo: pipetas

3. Artículos de consumo específicos, por ejemplo: prueba copas

4. Controles y materiales de Calibración tales como esos proporcionado por JAS Diagnostics.

PROCEDIMIENTO de ENSAYO:

Estas instrucciones deben ser utilizadas como una pauta general para adaptar instrumentos automatizados. Refiérase a sus instrucciones específicas para su instrumento (JAS), disponibles a su pedido.

Parámetros

Calcio

TEMPERATURA 37C

Longitud de Onda 650 nm

Tipo de Ensayo Punto Final

Dirección Aumentativo

Ratio: Muestra/Ensayo 1:50

Volumen de muestra 0.02 mL (20uL)

Volumen de reactivo 1.0 mL

Tiempo de Incubación >1 min

Notas del Procedimiento

1. El color final es fijo durante 60 minutos.

2. La contaminación de la cristalería con calcio afectará adversamente los resultados de la prueba. El vidrio de ácido-lavó o probetas plásticas se recomiendan.

3. Los volúmenes del reactivo y la muestra pueden necesitar ser ajustados según los requisitos del spectrophotometer específico siendo

utilizado.

CALCULOS

Absorbancia de prueba Conc X. de = Calcio (mg/dl)

Absorbance de Std uniforme.

Ejemplo:

Absorbance de la muestra = 0.81

Absorbance del estándar = 0.80

Concentración del estándar = 10 mg/dl

0.81 X 10 = 10.1 mg/dL Calcio

0.80

Limitaciones

1. Las muestras con calcio encima de 15.0 mg/dL se deben diluir 1:1 con salino, re-assayed, y el resultado multiplicado por dos.

2. Muestras severamente lipemicas se deben correr con un blanco del suero para la certeza más grande.

CALIBRACION:

Esta prueba debe ser calibrada utilizando un calibrador como el Calibrador de Quimica de JAS ( P/N: CAL1-5) o un estandard apropiado.

CONTROL DE CALIDAD:

La integridad de la reaccion debe ser evaluada usando un control de dos niveles con valores conocidos como el JAS Control de Quimica ( P/N: CON1-5 y CON2-5).

Valores Esperados:

Adultos: 8.5 - 10.4 mg/dL 15

Recién Nacido: 7.8 - 11.2 mg/dL 16

Se recomienda que cada laboratorio establezca su propio rango normal.

Linealidad:

Cuándo se evalua como recomendado el ensayo es linear desde 0.2 hasta 15.0 mg/dL.

Comparación del método:

Los estudios realizaron entre este procedimiento y una metodología semejante rindió los resultados siguientes:

Número de pares de muestras: 50

Fluctuacion de muestras: 5.2 – 15.0 (mg/dL)

Coeficiente de Correlación: 0.9927

Pendiente: 0.9835

Intercepto: -0.02 (mg/dL)

Precision:

Entre corridas Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3

Promedio (mg/dL) 6.60 9.70 12.21

S.D. (mg/dL) 0.04 0.08 1.16

C.V. (%) 0.7 0.8 1.3

Entre series Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3

S.D. (mg/dL) 0.1 1.14 1.18

C.V. (%) 1.5 1.4 1.4

Sensitividad:

Un factor de la calibración de aproximadamente 32.02fue obtenido, cuál equivale a una sensibilidad de 0.031 Δ Abs por mg/dl.

* NOTA: El desempeño se estableció en el Synchron CX.

Referencias:

1. Tietz, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, Philadelphia, W.B. Saunders, p.149 (1984).

2. Henry, J.B., Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, Philadelphia,, W.B. Saunders, p.149 (1984).

3. Call, J.P., et al, N.B.S., Sp. Publication 260:36 (1972).

4. Connerty, H.V. and Blggs, A.R., Clin. Chem. 11:716 (1965).

5. Glndler, E.M. and King, J.D., Am. J. Clin. Path. 58:376 (1972).

6 Connerty, H.V. and Blggs, A.R., Am. J. Clin. Path. 45:290 (1966).

7. Gitelman, H.J., Anal. Biochem. 18:521 (1967).

8. Baginski, E.S., St et al, Clin. Chem. Acta 46:49 (1973).

9. Richterich, R., Clinical Chemistry: Theory and Practice, New York, Academic Press, p.304 (1969).

10. Peters, J.P., Van Slyke, D.D., Quantitative Clinical Chemistry - Vot 2, Baltimore, Williams and Wilkins, (1932).

11. Chen, P.S., et al, Anal. Chem. 26:1967 (1954).

12. Tayeau, F., et al, Bull. Soc. Pharm. Bordeaux, 95:206 (1956).

13. Henry, R.J., et al, Clinical Chemistry: Principles and Technics, Hagerstown (MD), Harper and Row, p. 669 (1974).

14. Young, D.S., et al, Clin. Chem. 21:1D (1975).

15. Tietz, N.W., Fundamentals of Clinical Chemistry, Philadelphia, WE. Saunders, p. 1208 (1984).

16. Meites, Samuel, Pediatric Clinical Chemistry, Washington DC, AACC Press, p. 81 (1989).

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