BILIRUBINA DIRECTA JAS-YAZ (TÉCNICA)

BILIRUBINA DIRECTA JAS-YAZ (TÉCNICA)

USO

Este reactivo es utilizado para la determinación cuantitativa in vitro de Bilirubina Directa en suero humano.

SIGNIFICADO CLINICO

Los glóbulos rojos, al final de su vida circulante, son destruidos en el sistema retículo endotelial, principalmente en el bazo. El grupo hemo resultante, una vez separado del hierro, se convierte en bilirubina. Este proceso es responsable de aproximadamente un 80% de los 300 mg de bilirubina que se forman al día. Otras fuentes de bilirubina son la destrucción de mioglobina y citocromos y el catabolismo de glóbulos rojos inmaduros en la medula ósea.

Una vez formada, la bilirubina es transportada al hígado unido a la albúmina ya que es insoluble en agua. Esta fracción de bilirrubina se conoce como bilirrubina indirecta o no conjugada. En el hígado la bilirrubina se conjuga con ácido glucuronico (mono y diglucuronidos) para formar la bilirrubina conjugada por acción de enzima uridil di fosfato glucuronil transferasa. Esta bilirrubina conjugada o bilirrubina directa es excretada, vía estercobilinogeno por el intestino. La eliminación es casi completa y los niveles en plasma son normalmente despreciables.

La bilirrubina total es la suma de las fracciones conjugada y no conjugada. La bilirrubina total esta elevada en condiciones que causan obstrucción del conducto biliar, hepatitis, cirrosis, enfermedades hemolíticas y varias deficiencias enzimáticos heredadas. La bilirrubina indirecta esta elevada por causas pre-hepáticas tales como desordenes hemolíticos o enfermedades hepáticas que dan como resultado alteraciones en la entrada, transporte y conjugación en el hígado.

El monitoreo de la bilirubina en el recién nacido, particularmente si es prematuro, es de gran importancia. Puesto que el metabolismo hepático de la bilirubina en tales casos es inmaduro, es común la ictericia en el recién nacido, debida a un aumento de la bilirrubina no conjugada o indirecta. La bilirrubina no conjugada, si no esta unida a albumina, es capaz de atravesar la barrera hematoencefalica mas fácilmente, aumentando el peligro de daño cerebral.1

METODO

La mayoría de métodos actuales son basados en la reacción entre bilirubina y soluciones de ácido sulfanilico diazotados. En solución acuosa solo la bilirubina directa (conjugada) reaccionara de esta manera. Este reactivo de bilirubina directa usa el método de ácido diazo. Bilirubina Conjugada reacciona con ácido sulfanilico diazotado para producir un ácido azobilirubina, la absorbancia la cual es proporcional a la concentración de bilirubina directa en la muestra, puede ser medida a 550nm. Para analizadores bicromaticos la lectura del blanco debe ser tomada a 660nm.

COMPOSICION DEL REACTIVO

Ingredientes Activos Concentracion

HCI 103mM

Acido sulphanilic 9.8mM

Nitrito de Sodio 145mM

*PRECAUCIONES

1. No utilize la pipeta con la boca. Evite el contacto con

piel y ropa.

2. Este reactivo es para el uso diagnóstico in- vitro solamente.

PREPARACION DEL REACTIVO

1. Reactivo de prueba: Añadir el reactivo de Nitrito de Sodio al reactivo de Bilirubina Directa en proporción de 1:100. Por ejemplo, a 10mL de Reactivo de Bilirubina Directa, añadir 0.1mL de Nitrito de Sodio ( esto es aproximadamente 3 gotas de nitrito por cada 10mL de Reactivo de Bilirubina Directa)

2. Reactivo Blanco: Use el reactivo de Bilirubina Directa como se suple.

ALMACENAJE DEL REACTIVO

1. Almacenar el reactivo a temperatura de 2-25°C El reactivo es estable hasta la fecha de expiración.

2. El Reactivo de Trabajo es estable por lo menos 21 días almacenado de 2-8°C.

DETERIORO DEL REACTIVO

No utilice el reactivo si:

1. Esta turbio

2. La absorbancia es >0.1AU a 550nm

3. El reactivo falla en cumplir los parámetros de desempeño establecidos.

COLECCIÓN Y ALMACENAJE DE LA MUESTRA

1. Debe usarse muestras no hemolizadas.

2. Muestras deben ser protegidas de la luz brillante. Pueden ser almacenadas de 2-8°C por 3 dias.

INTERFERENCIA

1. Estudios para determinar el nivel de interferencia para hemoglobina y lipemia fueron realizados, se obtuvieron los siguientes resultados:

Hemoglobina: No interferencia significativa (+ 10%) hasta 300mg/dL

Lipemia: No interferencia significativa (+ 10%) hasta 723 mg/dL medida como trigliceridos.

2. Young, D.S.5 ha publicado un listado de drogas y sustancias que pueden interferir con el ensayo de Bilirubina Directa.

EQUIPO ADICIONAL REQUERIDO NO INCLUIDO

1. Analizador de química clínica capaz de mantener temperatura de 37°C constante y medir absorbancia a 550nm.

2. Agua deionizada y equipo relacionado,ej. Pipetas

3. Consumibles específicos para el analizador ej. Copas de Muestras

4. Material control como los suplidos por JAS Diagnostics.

PROCEDIMIENTO MANUAL

Test Blank

Reactivo de Trabajo (ml) 1.0 ------

Reactivo Bilirubina Directa (ml) ------ 1.0

Muestra (ml) 0.10 0.10

1. Identifique lus tubos de ensayo “blanco”, “control”, “paciente”, etc. Cada tubo require un tubo de blanco.

2. Añada 1.0mL de bilirrubina directa a todos los tubos de blanco.

3. Prepare un reactivo de trabajo. Vea la sección de Preparación del Reactivo en el inserto.

4. Añada 1.0mL del reactivo de trabajo a todos los tubos de ensayo.

5. Pre-caliente los tubos por aproximadamente 5 minutos a 37ºC.

6. A intervalos de tiempo añada 0.10mL (100μL) de muestra a los tubos correspondientes. Mezcle.

7. Deje descansar los tubos por 5 minutos a 37ºC.

8. Lleve el espectrofotómetro a cero con el reactivo blanco a 550nm (540-560nm).

9. Lea y registre la absorbancia de todos los tubos.

10. Vea la sección de cálculos en el inserto para obtener los resultados.

NOTA: El color continuara aumentando debido a la presencia de la fracción indirecta. El tiempo debe ser exacto para la medida precisa de la fracción directa.

PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO

Estas instrucciones son para ser utilizadas como una guía general para la adaptación al instrumento automatizado seleccionado por el usuario. Es recomendable que un blanco de muestra sea ensayado con cada muestra. Un blanco de muestra puede ser obtenido usando el reactivo de Bilirubina Directa como viene sin añadir el Nitrito de Sodio

PARAMETROS

Temperatura: 37°C

Largo de Onda 550nm

Tipo de Ensayo: Punto Final

Dirección: Aumentativo

Ratio: Muestra/Reactivo 1:20

Volumen de Muestra 0.05mL (50L)

Volumen de Reactivo 1.0 mL

Tiempo de incubación: 10 minutos

NOTAS DEL PROCEDIMIENTO

1. Los volúmenes de Muestra y Reactivo pueden ser alterados proporcionalmente para adaptarlos a los requisitos de varios instrumentos.

2. Muestras con valores mayores de 20mg/dL deben ser diluidas 1:1 con agua, y el resultado multiplicado por 2.

CALCULOS

Abs. Muestra - Abs. Blanco de muestra x Concentración Calibrador = BID2

Abs. Calibrador - Abs. Blanco del Calibrador (mg/dL) (mg/dL)

Ejemplo:

Absorbancia de la muestra = 0.350

Absorbancia Blanco muestra = 0.010

Absorbancia del Calibrador = 0.250

Absorbancia Blanco Calibrador = 0.010

Concentración del Calibrador = 4.0 mg/dL

0.350 – 0.010 x 4 = 5.7 mg/dL BID2

0.25 – 0.010

Nota: Para obtener valores en mmol/L multiplique mg/dL x 17.10 = mmol/L

Se requiere calibración. Este ensayo requiere el uso de un calibrador suero apropiado con valores conocidos de Bilirubina Directa, tal como el JAS Diagnostics Calibrador (CAL1-5).

CONTROL DE CALIDAD

La integridad de la reacción debe ser monitoreada con el uso de dos niveles de control con valores conocidos de Bilirubina Directa (CON1-5 and CON2-5). Los usuarios deben seguir las pautas o guias del gobierno referentes al uso de control de calidad externo.

VALORES ESPERADOS 6

Adultos e infantes mayores de 1 mes 0.0-0.2 mg/dL

Se recomienda que cada laboratorio verifique este rango o establezca su propio rango normal.7

DESEMPEÑO

Linearidad:

Cuando es evaluado como recomendado el ensayo es linear de 0 hasta 20 mg/dL.

Comparación del Método:

Los siguientes resultados fueron obtenidos mediante estudios realizados entre este procedimiento y uno similar:

Pares de Muestra 72

Rango de Muestras 0.00 – 20.8 mg/dL

Coeficiente de Correlación 0.9966

Pendiente 1.026

Intercepto 0.01 mg/dL

Precisión:

N=40

Entre Corridas Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3

Promedio (mg/dL) 0.20 1.83 2.98

S.D. (mg/dL) 0.00 0.03 0.00

C.V.(%) 0.00 1.7 0.00

Entre Corridas Nivel 1 Nivel 2 Nivel 3

N=40 (10 días, 2 corridas por día, 2 replicas por corrida)

Promedio (mg/dL) 0.20 1.83 2.98

S.D. (mg/dL) 0.00 0.08 0.15

C.V.(%) 0.00 4.3 5.2

Sensibilidad:

Un factor de calibración de aproximadamente 29.96 fue obtenido, el cual es equivalente a una sensitividad de 0.0334  Abs por mg/dL.

* NOTA: Desempeño establecido en el Synchron CX7.

REFERENCIAS

1. Zilva JF, Pannall PR. “Liver Disease and Gall Stones” in Clinical Chemistry in Diagnosis and Treatment”. Lloyd-Luke 1979; Chap XIII; 286-8

2. Malloy HT, Evelyn KA. J Biol chem 1937; 119-481-90.

3. Jendrassik L, Grof B. Biochem Zeit 1938; 297;81-9

4. Pearlman FC, Lee RT. Clin Chem 1974; 20:447-53

5. Young DS, Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests. Thirrd Edition. AACC Press 1990

6. Clinical Chemistry Theory, Analysis, and Correlation, 3rd ed. C.V. Mosby, St Louis, p.524 (1996)

7. Watchel M et al, Creation and Verification of Reference Intervals. Laboratory Medicine, 1995; 26:593-7

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